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Mathematical Modeling and Genetic Analysis of the Proneural Wave
 

 In addition to molecular genetic studies, we also focus on mathematical biology researches. By combining mathematical modeling and genetic analysis, we can understantd the nature of complex phenomena that are very hard to understand using conventional approaches. By experimantally proving the predictions obtaind by the methematical models, we elucidate the novel functions of gene networks.

 In the course of cell-cell communication, diffusible proteins act in a long range, while membrane proteins act in a short range. EGF and Notch play especially important roles for the long and short range cell-cell communications, respectively. However, how these two signaling systems behave when combined with each other remains elusive. We focused on the combined action of EGF and Notch during brain development. By experimentally proving the results of numerical simulations based on the mathematical model, we revealed that the roles of Notch significantly changes when combined with EGF function.

  To investigate the co-operation of EGF and Notch, we focused on the wave of differentiation in the fly brain or 'proneural wave', which is similar to the wave of differentiation found in other organisms. The short range action of Notch usually forms the salt-and-pepper pattern. However, Notch does not form the salt-and-pepper pattern during the proneural wave propagation. According to our mathematical model, it was predicted that reduction in EGF production should cause the formation of the salt-and-pepper pattern. Surprisingly, partial reduction in EGF signaling caused the formation of salt-and-pepper pattern in vivo, suggesting that the short range action of Notch is indeed implemented in the proneural wave and that the combination of Notch and EGF enables a novel function of Notch signaling that regulates the propagation of the wave of differentiation.
 
  The combinatorial actions of EGF and Notch are found in many biological processes including neural stem cell differentiation in the developing cerebral cortex and development of lund and breast cancers. Therefore, the mechanistic principles of gene network and the mathematical model established in this study might also be applied to the above biological processes in the future.


 

Notch-mediated lateral inhibition and reaction diffusion of EGF

 In this study, we focused on two signaling systems, EGF and Notch. EGF is a diffusible factor that act in a long range, while Notch is activated by a membrane bound ligand that act in a short lange. The short range action of Notch is called lateral inhibition. In the above figure a., blue cells are differentiated to red cells. As red cells send an inhibitory signal to the neighboring cells, blue cells are always situated adjacent to red cells, which is so called salt-and-pepper pattern. On the other hand, EGF has a long range effect that acts on cells distant from the EGF producing cells (figure b). Although both of them play very important roles in many biological processes, the combinatorial action of these two signaling systems remains elusive.  
 To investigate the co-operative functions of EGF and Notch, we focused on the wave of differentiation in the fly brain or 'proneural wave'. In the developing fly brain, all of the cells are undifferentiated neuroepithelial cells (blue cells), which are sequentially differentiated to neuroblast, a kind of neural stem cell (red cell), following the progress of the proneural wave (figure c). It has been shown that the proneural wave propagation is positively and negatively controlled by EGF and Notch, respectively.
  The Notch-mediated lateral inhibition is found in many biological processes of wide variety of animals. Furthermore, the conditions required for Notch-mediated lateral inhibition are fulfiled in the proneural wave. If Notch-mediated lateral inhibition is included in the proneural wave, the red and blue cells should show the salt-and-pepper pattern shown in figure a. However, no such pattern has been found in the proneural wave (figure c). So, the questions are as follow: Is Notch-mediated lateral inhibition included in the proneural wave? If so, why Notch does not couse the salt-and-pepper pattern, but controls the proneural wave propagation?
  Conventional biological approaches are not sufficient to answer these questions. We therefore established a mathematical model of the proneural wave. By combining the computer simulation and molecular genetic experiments, we investigated the dynamics of the gene network including EGF and Notch (figure d).



 
Salt-and-Pepper pattern is revealed by reducing EGF production rate
 

 我々はまずProneural WaveがNotchによる側方抑制を含んでいると仮定し,EGFの拡散とNotchによる側方抑制を組み合わせたProneural Waveの数理モデルを構築しました。興味深いことに,この数理モデルは生体内で見られるProneural Waveと非常に近い挙動を示しました(図a, c)。つまり,通常はゴマシオパターンを示さずに分化の波が進行する上,EGFの活性をなくしたEGF変異体においては波が消失し,Notchの活性をなくしたNotch変異体では波の進行が加速するなど,様々な変異体の状況も的確に再現したのです。EGFの拡散とNotchの側方抑制だけでProneural Waveの挙動を全く矛盾無く説明できたと言えます。  
 では,ゴマシオパターンは一体どこに行ってしまったのでしょうか?EGFは拡散性因子であり,Notchがゴマシオ状に活性化していたとしても,EGFの拡散効果によってそれが隠されてしまう可能性が考えられました。そこでシミュレーション上でEGFの拡散もしくは産生量を減少させたところ,そのような状況下ではゴマシオパターンが現れることが予測されました(図b)。EGFの活性が完全に無くなってしまうとそもそも波が消失してしまうため,我々はRNAiと呼ばれる技術によってEGFの活性を中程度に減少させることを試みました。その結果,Notchの活性および神経幹細胞の形成パターンがゴマシオ状に変化し,生体内においてもシミュレーション上と同じような互い違いのパターンが観察されました(図d)。これらの結果から我々の数理モデルが正しいこと,そしてNotchによる側方抑制が確かに生体内においてProneural Waveに含まれていることが示されました。


 
Temporal EGF activation causes wave acceleration in Notch mutant area
 

 私たちはこの数理モデルを用いてさらにもう一つの問題を解決しようと試みました。Notchの活性が失われたNotch変異領域では波の進行が加速しますが,この時EGFの活性が失われることが知られていました。EGFは波の進行において必須な因子であり,EGFが失われると波も失われるはずです。Notch変異領域ではEGFが失われているにもかかわらずなぜ波が消失せずにむしろ加速するのか,これまでの研究において解決されていない疑問点でした。  
 私たちは上記の数理モデルにおいてNotch変異領域を設定し(図a点線内),どのようなことが起きているか観察しました。興味深いことに,Notch変異領域において波が加速する際,一過的にEGFが活性上昇し,その後減衰することが分かりました。Notch自体は神経幹細胞の形成を阻害するので,EGFが活性化し,かつNotchが失われた状況では神経幹細胞の形成は加速するはずであり,これがNotch変異領域において波の進行が加速する原因であると考えられました。これと同じことが生体内でも起きているか調べたところ,シミュレーションと同様,EGFの活性が一過的に上昇していることが確認されました(図b)。このように,数理モデルを用いることによって従来の生命科学実験だけでは解決できない問題が解決されたのです。



 
 生命科学と数理科学の融合研究は世界的な潮流となっていますが,生命科学実験とシミュレーションを1対1に対応させて研究を推進する真の異分野融合研究はいまだ困難です。本研究では実際の生命現象に合致した数理モデルを構築し,その正しさを実験によって検証しました。さらに,EGFの減弱によってゴマシオパターンを再現する,Notch変異領域において波が消失せずにむしろ加速するメカニズムを明らかにするなど,数理モデルによる予測を実験的に検証することにより,NotchとEGFの協調作用のメカニズムを明らかにしました。
 EGFとNotchの協調作用は哺乳類大脳皮質の形成過程における神経幹細胞の分化,肺がん・乳がんの発症過程においても重要な役割を果たしていると考えられています。本研究によって明らかとなった遺伝子ネットワークの動作機構,およびその正確なシミュレーションを実現する数理モデルはヒトの脳の形成機構の解明,がんの進行をコントロールする技術の創出など,従来の生命科学研究だけでは解決できないような複雑な問題の解明に役立つと期待されます。

Sato, M., Yasugi, T., Minami, Y., Miura, T. and Nagayama, M.
Notch-mediated lateral inhibition regulates proneural wave propagation when combined with EGF-mediated reaction diffusion. Proceedings of the National Academy of Sciences 113, E5153-E5162 (2016).


 


   
  Institute for Frontier Science Initiative